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                    啤酒糟固态发酵产β—葡萄糖苷酶的研究
                    2015-12-21 10:53:39   来源:   评论:0

                         啤酒糟是啤酒工业中的主要副产物,是以大麦为原料,经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣。在国内,啤酒糟主要作为饲料被直接使用,利用效率很低。啤酒糟中含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维,氨基酸、糖类和多种微量元素,是良好的天然培养基,不仅可以发酵生产一些蛋白饲料,同时也可以用于工业酶制剂的生产。啤酒糟的再利用,可以增加啤酒工业的附加值,降低其生产成本。


                       文章来源华夏酒报;  β—葡萄糖苷酶又称β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶,它可以水解糖链末端非还原性的β—D—葡萄糖苷键。β—葡萄糖苷酶是纤维素酶的主要组成成分,直接影响着纤维素酶的降解能力。


                      此外,β—葡萄糖苷酶在食品行业中也有着广泛的应用,如作为水果和茶叶的风味酶,水解大豆异黄酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中,也存在于酵母、曲霉属、木霉属及一些细菌中。黑曲霉是公认安全的微生物之一, 在纤维物质的诱导下,黑曲霉可产生胞外β—葡萄糖苷酶。


                      笔者研究了黑曲霉固态发酵啤酒糟产β—葡萄糖苷酶的工艺条件,同时探讨了β—葡萄糖苷酶合成的动力学机制,望能为啤酒糟的再利用提供一定数据依据。


                         1 材料和方法
                         1.1 菌种
                         黑曲霉购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
                         1.2 试剂和设备
                         1.2.1 主要试剂
                         啤酒糟由蚌埠学院生物与食品工程系啤酒发酵实验室提供;
                         水杨苷(进口分装)、微晶纤维素(进口分装)、羧甲基纤维素钠(CMC)、 3, 5—二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚。
                         1.2.2 主要设备
                         752分光光度仪(上海菁华科技仪器有限公司)、DH Z—D冷冻恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)、SFAT—8000固态发酵罐(常州新区三环生物工程成套设备有限公司)。


                         1.3 培养基
                         斜面培养基:PDA培养基;
                         发酵培养基:啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中,用基本培养液调初始含水量,121℃灭菌20min。


                         1.4 试验方法
                         1.4.1 粗酶液的制备
                         黑曲霉在无菌条件下接入斜面培养基,30℃培养72h。每100ml  无菌水接入1环孢子配置种子悬浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比将种子悬浮液接入灭菌后的发酵培养基中,培养96h。用100ml去离子水浸提培养基,搅拌1h,抽滤,在3000r/min条件下离心15min,收集上清液,即为粗酶液。
                         1.4.2 单因素分析
                         在其他条件不变的情况下,分别测定不同温度、料液比和接种量对β—葡萄糖苷酶酶活的影响。
                         1.4.3 正交分析
                         利用L9( 34 )正交试验优化β—葡萄糖苷酶的发酵条件。
                         1.4.4 动力学研究
                         发酵过程中,每隔24h分别测定发酵培养基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性,分析β—葡萄糖苷酶酶活随时间的变化情况。


                         1.5 酶活力的测定
                         1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的测定。取4支洗净烘干的10ml具塞刻度试管, 编号后各加入1.5ml0.5%水杨酸苷柠檬酸缓冲液,向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性,作为空白对照,比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5min—10min,再各加入酶液0.5ml,50℃水浴中保温30min,取出后立即分别向2、3 和4号试管中加入1.5ml DNS 溶液以终止酶反应,充分摇匀后沸水浴5min,取出冷却后用蒸馏水定容至10ml,充分混匀。
                         以1号试管溶液为空白对照调零点,测定2、3和4号试管液的吸光度值并记录结果。定义在测定条件下,1min内水解水杨酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。


                         1.5.2 葡萄糖内切酶(CX)活力的测定 以羧甲基纤维素钠为底物,方法同上。
                         1.5.3 葡萄糖外切酶(C1)活力的测定 以微晶纤维素为底物,方法同上。
                         1.5.4 还原糖的测定 采用DNS(3,5—二硝基水杨酸)法。


                         2 结果与分析


                         2.1单因素分析
                         温度是黑曲霉生长的重要条件之一,它不仅影响着菌体的生长速率,同时也制约着代谢产物的水平。在30℃条件下,β—葡萄糖苷酶的活力最高,而40℃时酶活最低。值得注意的是,从培养基孢子生长情况上看,25℃条件下,黑曲霉产生的孢子稀疏,主要以菌丝体为主;而在37℃条件下,孢子生长的十分密集,但两者β—葡萄糖苷酶的酶活相差不是很大。


                         这一现象表明,两种产酶机制的不同,25℃更适合β—葡萄糖苷酶的生成,而37℃时,虽然产酶水平不高,但孢子数量巨大,产生的总酶活也高。
                         在固态发酵中,初始含水量主要影响着菌体对氧气的摄取。按料液比(培养基:水,g/ml)1:5配置培养基的初始含水量时酶活最高。当含水量过高时,由于限制了培养基对氧的摄取,产酶水平开始下降。


                         在一定范围内,随着接种量的增大,酶活逐渐变大,当接种量增大到10%以上后,酶活变化减小,这可能是由于菌种数量过大,导致培养基营养成分的迅速消耗,从而影响酶的产量(见表2)。


                         2.2正交试验优化发酵工艺
                         利用正交表设计L9( 34 )正交试验, 温度的三个水平分别为25℃、30℃和37℃;含水量分别为1:1、1:3 和1:5;接种量为2%、5%和10%(见表1)。


                         可以看出, 在25℃、含水量1:5和接种量10%的条件下, 酶活达到10.85U / g;其中含水量对β—葡萄糖苷酶酶活具有显著的线型相关( p< 0.05)。


                      2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
                         葡萄糖苷酶是纤维素酶的重要组成成分,在很大程度上决定着纤维素酶的活性。以啤酒糟为培养基,在30℃,接种量10%和料液比1:5的条件下,利用固态发酵罐进行发酵,每隔24h测定黑曲霉产β—葡萄糖苷酶, 绘制各种酶的酶活变化曲线。


                         Cx酶在72h时达到产酶的高峰期,而β—葡萄糖苷酶的酶活则继续增大。在96h后,β—葡萄糖苷酶酶活的增幅变小,这一现象可能说明,在96h时该酶已经进入产酶的高峰期;此后,由于菌丝体发生自溶,胞内的β—葡萄糖苷酶释放到培养基中,使酶活进一步变大。利用啤酒糟作为培养基,β— 葡萄糖苷酶的酶活要远高于Cx酶,而用其它培养基时,Cx酶的酶活要高于β—葡萄糖苷酶,这表明啤酒糟适合于β—葡萄糖苷酶的发酵生产。

                     


                         3 结论


                         目前,β—葡萄糖苷酶主要是利用微生物发酵进行生产,尤其是黑曲霉和米曲霉,培养基多为麸皮、蛋白胨和各种无机盐。


                      有研究表明,初始pH值对于β—葡萄糖苷酶的产量有着重要的影响。


                         啤酒糟富含各种营养成分,有利于诱导β—葡萄糖苷酶的产生,可能成为该酶发酵生产的天然培养基。实验表明,在25℃,料液比1:5和接种量10%的固态发酵条件下,酶活可达到10.85U / g;动力学研究显示,β—葡萄糖苷酶在96h进入产酶高峰期,120h时达到酶活最高值。此外,发酵后的啤酒糟由于纤维结构被破坏,从而更容易被动物吸收,可能成为较好的有机饲料。


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                    编辑:苗倩

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